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問題
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原因
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解決方案
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條帶形狀不好看
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膠凝的不均勻，聚合不好
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灌膠前將溶液充分混勻
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上樣齒扭曲使上樣孔大小不一
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上樣前用針頭將齒撥正，注意不要將針頭插入膠內(nèi)
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某些樣品鹽濃度較高
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除鹽或?qū)悠符}濃度調(diào)成一致
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每孔上樣量不一致
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調(diào)整上樣量使基本一致
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緩沖液陳舊，成分改變
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重配
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凝膠下面有氣泡
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電泳前先將氣泡趕走
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電泳時(shí)溫度過高
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降低電流或電壓
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目的蛋白信號(hào)弱
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樣品上樣量不足或目的蛋白濃度過低
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加大上樣量或濃縮樣品
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轉(zhuǎn)膜效率低
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以下單列
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抗體濃度低
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增加抗體濃度或延長孵育時(shí)間
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顯色劑底物濃度不足
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增加顯色劑用量
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顯色劑失效
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更換顯色劑（吸取A、B液的槍頭不可混用）
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顯色或曝光時(shí)間不足
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延長顯色或曝光時(shí)間
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轉(zhuǎn)膜效率低
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轉(zhuǎn)膜緩沖液pH值與目的蛋白等電點(diǎn)相近
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提高轉(zhuǎn)膜緩沖液pH值
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凝膠與膜之間存在氣泡
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轉(zhuǎn)膜前要排盡氣泡
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凝膠與轉(zhuǎn)印膜兩側(cè)濾紙大面積接觸
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濾紙、轉(zhuǎn)印膜和凝膠大小要基本一致，避免濾紙直接接觸
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轉(zhuǎn)印膜種類選擇不當(dāng)
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使用質(zhì)量可靠的PVDF膜或硝酸纖維素膜
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電壓或電流過小
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濕轉(zhuǎn)時(shí)20mA恒流，半干轉(zhuǎn)時(shí)25V左右恒壓
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轉(zhuǎn)印時(shí)間過長或過短，蛋白還在凝膠中或穿透轉(zhuǎn)印膜
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先電泳，根據(jù)蛋白大小及轉(zhuǎn)印裝置選擇合適的轉(zhuǎn)印時(shí)間
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濕轉(zhuǎn)過程中環(huán)境溫度過高
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使用預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液或?qū)⒀b置至于4度
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顯色或曝光后無條帶
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膠與膜方向反了
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轉(zhuǎn)膜時(shí)應(yīng)依次放好PDVF膜與凝膠所對應(yīng)的電極,即凝膠對應(yīng)負(fù)極,PDVF膜對應(yīng)正極。
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選用的一抗、二抗及顯色方法不合適
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選擇合適的一抗、二抗和顯色方法
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目的蛋白含量低于檢測下限
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加大上樣量或濃縮樣品
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抗體效價(jià)過低
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增加抗體濃度
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抗體孵育時(shí)間不足
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延長孵育時(shí)間，37°C孵育1小時(shí)以上
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抗體過度洗滌
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減少洗滌時(shí)間及次數(shù)
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加入HRP底物反應(yīng)與曝光檢測之間間隔時(shí)間過長
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反應(yīng)3到5分鐘及時(shí)檢測
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背景過高
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封閉物用量不足
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提高封閉物濃度，孵育時(shí)保證封閉液完全浸沒轉(zhuǎn)印膜
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封閉物使用不當(dāng)
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檢測生物素標(biāo)記的蛋白時(shí)不可用脫脂奶粉封閉
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封閉時(shí)間不夠
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室溫37度封閉1小時(shí)以上，4度封閉過夜
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抗體非特異性結(jié)合
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降低抗體濃度，減少孵育時(shí)間
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抗體濃度過高或洗滌不夠
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降低抗體濃度，增加洗滌次數(shù)和時(shí)間
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化學(xué)顯色底物過多
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按說明書加入適量的顯色底物
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雜帶多
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雜蛋白多
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處理目的蛋白
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抗體特異性不強(qiáng)
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使用特異性強(qiáng)的抗體
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抗體孵育時(shí)間過久
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減少抗體孵育時(shí)間
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二抗與抗原有交叉反應(yīng)
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選擇合適的封閉物
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底物顯色與曝光時(shí)間長了
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縮短顯色及曝光的時(shí)間
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大分子量WB
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膜孔徑太小
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更換孔徑較大的膜
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轉(zhuǎn)膜電壓電流低
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提高電壓/電流
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轉(zhuǎn)膜時(shí)間短
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延長轉(zhuǎn)膜時(shí)間
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膠濃度太大
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使用低濃度的膠
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轉(zhuǎn)膜緩沖液配方不合適
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調(diào)整轉(zhuǎn)膜緩沖液中甲醇及SDS濃度
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